Validação

A validação de métodos analíticos de toxicologia tem objetivo voltado para confiabilidade do método que foi escolhido para obter os determinados resultados.

Desta forma, a necessidade de validar um método está ligada a redução ou controle dos fatores que podem levar, por exemplo, a imprecisão ou inexatidão de um método gerado.

É importante ressaltar alguns parâmetros de validação tais como: Precisão, exatidão, linearidade, recuperação, limite de detecção e de quantificação, especificidade, robustez e estabilidade do analito, que serão explicados resumidamente a diante.

A PRECISÃO avalia a proximidade entre as várias medidas obtidas na mesma amostra, levando em conta a reprodutibilidade e a repetibilidade. A repetibilidade está ligada a condições que os resultados independentes são obtidos usando mesmo método, operador, laboratório e equipamentos, além de ser em um curto intervalo de tempo. Já a reprodutibilidade diferencia-se já que apesar de usar mesmo método para mesma amostra, usa-se não só laboratórios, mas tbm operadores e equipamentos diferentes.

A EXATIDÃO trata-se da diferença entre o valor real presente na amostra e o valor obtido na análise. É avaliada através da inexatidão, ou seja, o afastamento entre os valores esperado e obtido.

Quanto a LINEARIDADE, esta é a capacidade de um método gerar resultados proporcionais à concentração da espécie em análise, dentro de uma faixa analítica especificada. Ela é determinada pela análise de uma série de calibradores, abrangendo a faixa de concentração de interesse no trabalho, o que possibilita a curva de calibração.

A RECUPERAÇÃO avalia a eficiência do método de tratamento da amostra e expressa a variação de resposta obtida entre a quantidade de analito adicionada antes da extração e aquela decorrente da adição da mesma quantidade do analito após o processo de extração.

Tratando-se dos LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO, temos que:

- Limite de detecção (LOD) é a menor concentração ou quantidade de analito que pode ser identificada com um nível de confiança especificado ou ainda, que pode ser estatisticamente diferenciada do ruído.

- Limite de quantificação (LOQ) é a menor concentração do analito que pode ser quantificada com uma precisão especificada.

A SENSIBILIDADE de um método indica sua capacidade de discriminar, com uma fidelidade estabelecida, concentrações próximas de um analito. Porém é importante ressaltar que sensibilidade é diferente de LOD.

A SELETIVIDADE é à capacidade de um método em determinar o analito na presença de outras substâncias prováveis de interferirem na determinação. Já a especificidade se refere a um método específico para um único analito, enquanto seletividade diz respeito a um método que permite a análise de várias substâncias que podem ou não ser distinguíveis.

A ROBUSTEZ é a capacidade do resultado de um método permanecer inalterado por pequenas mudanças de parâmetros operacionais e ambientais, como temperatura do ambiente, pH, concentração da fase móvel (HPLC), materiais de diferentes procedências etc.

E, finalmente, a ESTABILIDADE da substância em teste poderá ser feita em relação a matriz de trabalho nas seguintes condições:

Durante armazenamento tendo: temperatura ambiente, temperatura de geladeira (4°C), temperatura de congelamento (-20°C), Ciclos de congelamento e descongelamento (3ciclos).

Foi possível experimentar o processo de validação na aula prática de análise de salicemia em uma amostra de salgueiro disponibilizada pela professora, além do momento de elaboração e organização dos dados obtidos e expostos nas tabelas a seguir e também no gráfico confeccionado.

 

(clique na imagem para ampliá-la)

Os valores relacionados aos r’s de 1 a 5 são as absorbâncias encontradas por cada grupo em determinadas e conhecidas concentrações da amostra. Calculou-se então a média das absorbâncias, o desvio das mesmas em relação às medias encontradas, a precisão e, a partir destes valores, foi possível então encontrar a concentração obtida nas amostras e a inexatidão dos experimentos.

Considerando que se pretende comprovar que são obtidas recuperações numericamente iguais às concentrações reais, o coeficiente angular deve ser o mais próximo possível ou igual a 1, sendo que não deve ser inferior a 0,98. Para tal, houve a necessidade de exclusão de um ponto, que levou a uma melhor visualização dos resultados e ao coeficiente angular ideal.