Alcoolemia

O álcool e as drogas de abuso são as substâncias que, na atualidade, fazem parte da maioria das requisições de exames toxicológicos.

O consumo de bebidas alcoólicas pode ocasionar intoxicação acidental ou voluntária, ou mesmo profissional, sendo o agente tóxico responsável o álcool etílico (ou etanol).

A intoxicação pode resultar da ingestão de bebidas alcoólicas em quantidade variável, de forma esporádica ou habitual, podendo dar origem a intoxicações agudas no primeiro caso ou crônicas no segundo.

As intoxicações agudas apresentam formas leves (embriaguez), que pode ter elevado interesse médico-legal, pela sua influência na condução rodoviária, pelo seu importante efeito criminal e por várias outras questões de ordem legal que se podem colocar como, por exemplo, questões de responsabilidade penal. As formas graves desta intoxicação são esporádicas, podendo em alguns casos ser causa de morte. Nestes casos, em virtude dos sintomas, é por vezes difícil o diagnóstico diferencial com situações de traumatismo craniano.

As intoxicações crônicas têm consequências importantes, por exemplo a nível clínico originando gastrites, dispepsia, miocardites ou cirroses, e em termos psiquiátricos levando a quadros patológicos como delirium tremens, alucinações ou demências.

As determinações de alcoolemia (etanol no sangue) podem ser realizadas com apenas um único substrato, o sangue. Contudo, e em especial para o sangue, existem condições em que não é possível obter as amostras mais apropriadas de uma forma qualitativa e/ou quantitativa, particularmente em situações de putrefação avançada, exumações ou de mortes por choque traumático. Neste caso, deve-se recorrer a amostras alternativas ou complementares, que apenas nos permitem inferir acerca da concentração provável de tóxico presente no sangue. Na determinação de álcool etílico é possível efetuar essa pesquisa em diversos outros fluídos, tais como urina, humor vítreo, líquido sinovial, medula óssea ou saliva.

A determinação de etanol no sangue pode ser realizada por métodos químicos, enzimáticos e cromatográficos, sendo a cromatografia o método mais indicado para a dosagem de substâncias voláteis como o etanol e o compostos relacionados em fluidos biológicos.

As técnicas utilizadas na cromatografia são classificadas como: injeção direta, extração e destilação e headspace. A técnica de headspace é a mais empregada em cromatografia gasosa e é utilizada frequentemente na clínica e na análise toxicológica forense de componentes voláteis, sendo muito eficiente na detecção e identificação destes compostos.

Extrações

Extração líquido-líquido

A extração líquido-líquido é uma técnica usada quando se deseja remover de uma mistura de líquidos, um ou mais componentes, denominados solutos, através do contato direto com um liquido chamado de solvente, que é imiscível com a mistura original e remove parcialmente os componentes desejados desta mistura.  O solvente extrai componentes presentes em uma amostra biológica como, por exemplo, sangue, urina, dentre outros.

As drogas são extraídas para um solvente quando o pH do meio converte o analito na sua forma neutra, por exemplo:

– Ácidos carboxílicos são extraídos em pH <4

– Aminas são extraídas em pH >8

De acordo com analito que se quer extrair escolhe-se o solvente mais adequado, por exemplo, para THC o hexano é o solvente preferido uma vez que acetato de etila produz extratos “sujos” e para morfina um solvente mais polar é utilizado (clorofórmio/álcool isopropílico).

A extração líquido-líquido pode ser contínua ou descontínua.

Na extração descontínua utiliza-se um funil de separação, onde ambos os solventes são adicionados. Com a agitação do funil de separação, o soluto passa a fase na qual está o solvente com maior afinidade. A separação é feita, então, sendo que a fase mais densa é recolhida antes.
A extração líquido-líquido descontínua é indicada quando existe uma grande diferença de solubilidade do soluto nos dois solventes (grande K_D).

Na extração líquido-líquido contínua, o solvente orgânico passa continuamente sobre a solução contendo o soluto, levando parte deste consigo, até o balão de aquecimento. Como o solvente está sendo destilado, o soluto vai se concentrando no balão de aquecimento.

É um processo útil para quando a diferença de solubilidade do soluto em ambos os solventes não é muito grande (baixo valor de K_D). 

Extração em fase sólida

A extração em fase sólida permite não só a extração eficiente do s analitos, mas também possibilita sua concentração e pré-purificação. Destaca-se o fato de que não é necessário que o solvente seja insolúvel no fluido que contém a amostra, uma necessidade essencial para a extração com solventes fluidos (exemplo na líquido-líquido).

A fase sólida ainda retém com eficiência analitos presentes em líquidos, gases ou fluidos supercríticos, associando enorme versatilidade à técnica. A extração em fase sólida é realizada como uma cromatografia em coluna, mas com pouco sorvente e seletiva para o conjunto de analitos de interesse, em relação a interferentes e matriz.

As etapas envolvidas na extração SPE são:

a)        Ativação do sorvente pela passagem de solvente apropriado para condicionar a superfície do sólido (exemplo metanol); remoção do solvente de ativação por um líquido de composição similar a amostra (exemplo água);

b)        Aplicação da amostra: idealmente os analitos são retidos pelo sorvente (retenção);

c)        Remoção de interferentes e parte da matriz com um solvente que não remova os analitos (etapa de lavagem).

d)        Eluição dos analitos do sorvente com um solvente apropriado, de preferência que não desloque componentes da matriz que ainda estejam associados ao sorvente, coletando o eluato para eventual concentração e posterior análise.

 Fonte:www.poswb.com.br

Esquema representando as etapas envolvidas na extração

O caso clássico de aplicação de SPE implica na percolação da amostra através do sorvente, quando componentes da amostra são eluidos e os analitos com um ou mais solventes. Em seguida, os analitos são eluidos com solvente apropriado de modo a deixar no sorvente outros componentes da matriz que não tenham sido removidos pela lavagem.

As vantagens da SPE em relação à extração líquido-líquido, além de extrair, concentrar e purificar os analitos, incluem menor uso de solventes, não formar emulsão, fácil automação e geralmente maior rapidez, com redução do tempo gasto em até um quinto do despendido na extração líquido-líquido.

Tradicionalmente seis sistemas foram estabelecidos para interação de componentes de uma fase fluida com uma fase sólida, que se valem das diferentes possibilidades de interação físico-química entre as moléculas:

1 – Fase normal: A fase sólida é polar e a fase líquida menos polar.

2 – Fase reversa: Fase sólida é apolar e líquida mais polar.

3 – Troca iônica: A fase sólida incorpora íons fixados a ela, os quais por sua vez retém contra-íons. Íons da amostra presentes na fase móvel podem deslocar os contra-íons originais, fixando-se em seu lugar.

4 – Complexante: Fase sólida incorpora grupos quelantes fixados a ela, os quais por sua vez retém analitos por complexação.

5 – Exclusão por tamanho: Fase sólida contém poros de dimensões determinadas que capturam moléculas menores e excluem as maiores.

6 – Associação a receptor biológico: Fase sólida incorpora receptores elaborados por sistemas biológicos fixados a ela, os quais por sua vez retém analitos que tenham afinidade pelos mesmos.

Referências:

http://www.qmc.ufsc.br/organica/exp7/liquido.html

http://www.maeq.ufba.br/scripts/docs/pdf/extracaoliquidoliquido.pdf

http://www.poswb.com.br

Validação

A validação de métodos analíticos de toxicologia tem objetivo voltado para confiabilidade do método que foi escolhido para obter os determinados resultados.

Desta forma, a necessidade de validar um método está ligada a redução ou controle dos fatores que podem levar, por exemplo, a imprecisão ou inexatidão de um método gerado.

É importante ressaltar alguns parâmetros de validação tais como: Precisão, exatidão, linearidade, recuperação, limite de detecção e de quantificação, especificidade, robustez e estabilidade do analito, que serão explicados resumidamente a diante.

A PRECISÃO avalia a proximidade entre as várias medidas obtidas na mesma amostra, levando em conta a reprodutibilidade e a repetibilidade. A repetibilidade está ligada a condições que os resultados independentes são obtidos usando mesmo método, operador, laboratório e equipamentos, além de ser em um curto intervalo de tempo. Já a reprodutibilidade diferencia-se já que apesar de usar mesmo método para mesma amostra, usa-se não só laboratórios, mas tbm operadores e equipamentos diferentes.

A EXATIDÃO trata-se da diferença entre o valor real presente na amostra e o valor obtido na análise. É avaliada através da inexatidão, ou seja, o afastamento entre os valores esperado e obtido.

Quanto a LINEARIDADE, esta é a capacidade de um método gerar resultados proporcionais à concentração da espécie em análise, dentro de uma faixa analítica especificada. Ela é determinada pela análise de uma série de calibradores, abrangendo a faixa de concentração de interesse no trabalho, o que possibilita a curva de calibração.

A RECUPERAÇÃO avalia a eficiência do método de tratamento da amostra e expressa a variação de resposta obtida entre a quantidade de analito adicionada antes da extração e aquela decorrente da adição da mesma quantidade do analito após o processo de extração.

Tratando-se dos LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO, temos que:

- Limite de detecção (LOD) é a menor concentração ou quantidade de analito que pode ser identificada com um nível de confiança especificado ou ainda, que pode ser estatisticamente diferenciada do ruído.

- Limite de quantificação (LOQ) é a menor concentração do analito que pode ser quantificada com uma precisão especificada.

A SENSIBILIDADE de um método indica sua capacidade de discriminar, com uma fidelidade estabelecida, concentrações próximas de um analito. Porém é importante ressaltar que sensibilidade é diferente de LOD.

A SELETIVIDADE é à capacidade de um método em determinar o analito na presença de outras substâncias prováveis de interferirem na determinação. Já a especificidade se refere a um método específico para um único analito, enquanto seletividade diz respeito a um método que permite a análise de várias substâncias que podem ou não ser distinguíveis.

A ROBUSTEZ é a capacidade do resultado de um método permanecer inalterado por pequenas mudanças de parâmetros operacionais e ambientais, como temperatura do ambiente, pH, concentração da fase móvel (HPLC), materiais de diferentes procedências etc.

E, finalmente, a ESTABILIDADE da substância em teste poderá ser feita em relação a matriz de trabalho nas seguintes condições:

Durante armazenamento tendo: temperatura ambiente, temperatura de geladeira (4°C), temperatura de congelamento (-20°C), Ciclos de congelamento e descongelamento (3ciclos).

Foi possível experimentar o processo de validação na aula prática de análise de salicemia em uma amostra de salgueiro disponibilizada pela professora, além do momento de elaboração e organização dos dados obtidos e expostos nas tabelas a seguir e também no gráfico confeccionado.

 

(clique na imagem para ampliá-la)

Os valores relacionados aos r’s de 1 a 5 são as absorbâncias encontradas por cada grupo em determinadas e conhecidas concentrações da amostra. Calculou-se então a média das absorbâncias, o desvio das mesmas em relação às medias encontradas, a precisão e, a partir destes valores, foi possível então encontrar a concentração obtida nas amostras e a inexatidão dos experimentos.

Considerando que se pretende comprovar que são obtidas recuperações numericamente iguais às concentrações reais, o coeficiente angular deve ser o mais próximo possível ou igual a 1, sendo que não deve ser inferior a 0,98. Para tal, houve a necessidade de exclusão de um ponto, que levou a uma melhor visualização dos resultados e ao coeficiente angular ideal.

Análise toxicológica: Fundamento e finalidades

   No Brasil, como em outros países, a existência de agências especializadas em vigilância sanitária, deve-se à necessidade das sociedades organizadas controlarem e garantirem a qualidade sanitária de produtos e serviços consumidos pela população, de forma a evitar agravos à saúde e contaminação ambiental.

    A Toxicologia, como a ciência que abrange todos os aspectos do estudo do efeito adverso de substâncias químicas, é considerada como uma ciência básica e aplicada.     As análises toxicológicas, qualquer que seja a área da toxicologia a que se destinam, envolvem detecção, identificação e quantificação das substâncias relevantes do ponto de vista toxicológico e a interpretação dos resultados. Esta ciência abrange a monitorização terapêutica, a monitorização biológica, o controle antidopagem, o controle da farmacodependência, assim como análises em substratos não biológicos como ar, alimentos, água, solo, dentre outros.

    Os resultados obtidos das análises toxicológicas estabelecem a relação de causa e efeito, ou seja, se houve ou não a intoxicação sobre a qual recai a suspeita e, por este motivo, deve ser gerado à luz de conhecimentos que possibilitem que os mesmos sejam inequívocos e, por conseguinte, o laudo gerado deve ser irrefutável.

    Fatores importantes para que o resultado obtido das análises seja confiável: cadeia de custódia, que envolve a documentação desde a coleta da amostra até a obtenção dos resultados finais das análises; manuseio correto das amostras; correta identificação de cada amostra recebida e integridade da mesma. 

    As matrizes biológicas utilizadas na caracterização da exposição humana, em testes in vivo, são: urina, plasma, sangue, saliva e cabelo, podendo ser utilizadas matrizes alternativas como suor, unha, mecônio, tecidos e cabelos de recém-nascidos, como exemplifica a verificação de suspeição de exposição intra-uterina. 

     As matrizes biológicas normalmente utilizadas na caracterização da exposição humana, em análises post mortem, são: sangue total (aorta, cavidade cardíaca e femoral), humor vítreo e vísceras, como fígado e rins, e cérebro.

    As análises toxicológicas têm como finalidade:

•    Estudar Métodos Analíticos para a Determinação de Drogas de Abuso. Desenvolver metodologias analíticas empregando as técnicas de cromatografia em fase gasosa e técnicas de extração e preparação de amostras para a determinação de drogas de abuso lícitas e ilícitas em amostras biológicas. Investigar a presença de drogas de abuso em amostras biológicas alternativas. Determinação de drogas de abuso em amostras biológicas postmortem. Avaliar correlações entre o abuso de drogas ilícitas e causas de mortes, como por exemplo, o caso recente da morte da cantora britânica Amy Winehouse.

•    Análise de Metais em Alimentos e Fluidos Biológicos. Especiação química de metais e semi-metais. Estudo de dieta total e estimativa de ingestão diária de elementos essenciais e tóxicos através de dados de consumo alimentar médio.

•    Biomonitoramento – Avaliação de Populações Expostas a Metais  e seus Efeitos. Efeitos no sistema cardiovascular e nervoso. Utilização de biomarcadores de dose interna que não requerem coleta invasiva.  Avaliação de biomarcadores de susceptibilidade. Influência de fatores genéticos (polimorfismos genéticos) e nutricionais na toxicologia de alguns metais como mercúrio, cádmio, chumbo, arsênio, manganês. Estabelecimento de valores de referência para metais tóxicos e essencias em populações.

•    Análise de Fármacos e Medicamentos. Utilização de técnicas modernas de análise (eletroforese capilar, cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas) e de preparação de amostras (microextração em fase sólida e microextração em fase líquida) no desenvolvimento de métodos de análise de fármacos e metabólitos visando aplicação em estudos de disposição cinética e metabolismo.

Fontes: http://www.anvisa.gov.br/reblas/pesquisa_toxicologia_forense.pdf
             http://ltc.nutes.ufrj.br/toxicologia/creditoins.htm

Doping no esporte!

O Conselho Nacional de Esporte define como doping, de acordo com a Resolução 02/2004, “a substância, agente ou método capaz de alterar o desempenho do atleta, a sua saúde ou espírito do jogo, por ocasião de competição desportiva ou fora dela”. Por dopagem se entende a administração ao atleta, ou o uso por parte deste, de substância, agente ou método capaz de alterar o seu desempenho, prejudicar a sua saúde ou comprometer o espírito do jogo.

A busca pelo desempenho ótimo tem sido uma constante no esporte de alto rendimento. Para tanto, muitos atletas acabam utilizando drogas e métodos ilícitos, os quais podem ter importantes efeitos adversos. Considera-se infração por dopagem, o uso de substância proibida, ou a presença de seus metabólitos ou marcadores na urina ou sangue do atleta, o uso ou a tentativa de uso de substância ou método proibido, a adulteração ou tentativa de adulterar qualquer parte do controle de dopagem, a posse ilegal e o tráfico ilícito de qualquer substância ou método proibido.

A Agência Mundial Anti-Doping (WADA, World Anti-Doping Agency), composta igualmente pelos setores esportivos e governamentais do mundo todo, é a responsável pelo documento que aborda as políticas anti-doping em todos os esportes e em todos os países, o Código Mundial Anti-Doping. Anualmente, a WADA publica a Prohibited List, uma lista atualizada com substâncias e métodos proibidos no esporte.

 

A lista completa pode ser encontrada clicando AQUI.

A luta contra a dopagem compreende, idealmente, não só a programação de controles antidoping durante e fora de competições esportivas, mas especialmente uma conscientização e orientação dos atletas a respeito desta importante temática. No vídeo abaixo, produzido pela WADA, é explicado como se procede no recrutamento de atletas e coleta de amostras para fins de controle anti-dopagem.

 

Em estudo publicado em 2004, Rose e cols. apresentam um panorama da realidade do doping no esporte brasileiro. Ao consultar os dois únicos laboratórios de controle anti-doping do país, o Laboratório de Controle de Dopagem da Universidade Federal do Rio de Janeiro e o Laboratório de Análises Toxicológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, os autores obtiveram os seguintes dados, conforme apresentado nas tabelas abaixo:

As substâncias encontradas nos exames em competição foram em sua maioria agentes anabólicos (anabólicos esteróides) (n = 8), sendo as demais: estimulantes (n = 6), diuréticos (n = 2), hormônios peptídicos (n = 1), canabinóides (n = 1) e narcóticos (n = 1). As drogas consideradas de "uso social" cujos metabólitos, devido às técnicas modernas de detecção, podem ser observados até por uma semana pela análise da urina do atleta, e que são também banidas pela legislação cível brasileira, como a benzoilecgonina (cocaína) e o THC (cannabis), perfizeram quase que a terça parte das drogas encontrada em competição. Neste sentido, chama a atenção o fato de o único caso positivo no fisiculturismo não ter sido pelo uso de anabolizante, que sabidamente melhora artificialmente a performance nesta modalidade, mas sim pelo uso de THC, o que evidencia mais uma vez o problema do uso de "drogas sociais" pelos atletas.

O baixo percentual de exames positivos detectados no controle antidoping apresentados no estudo não necessariamente apontam para a baixa utilização de substâncias e métodos pelos atletas brasileiros.  Em entrevista ao site da SporTv, o treinador Ricardo Cintra relata: “Posso afirmar, com convicção, que não há atleta de elite que não faça o uso de algum tipo de suplemento alimentar. Não é possível ter uma recuperação adequada entre treinos e competições sem o uso dos produtos”. A nutróloga Maria Vargas, especializada em alimentação de atletas, descorda: “Há estudos que comprovam que não há muita diferença de desempenho entre pessoas que fazem atividades físicas utilizando suplementos e indivíduos que praticam exercícios apenas fazendo uma alimentação adequada. Muitas das vezes, o efeito do suplemento é psicológico. A pessoa apenas acha que está tendo melhora de desempenho por estar tomando algum produto”. 

Opiniões à parte, o fato é que o caso do doping deve ser discutido e encarado com preocupação pelos profissionais do esporte, já que o uso abusivo dessas substâncias traz efeitos adversos graves que podem comprometer a saúde do atleta.